sponsorowaneChoroby przenoszone przez komary Homogenizacja w kontrolowanej temperaturze zapewniająca niezawodne wykrywanie RNA w ramach monitorowania komarów

W jaki sposób młyn wibracyjny Retsch MM 500 control rewolucjonizuje przygotowywanie próbek w laboratoriach monitorujących

Choroby przenoszone przez komary – rosnące wyzwanie o zasięgu globalnym

W wyniku zmian klimatycznych, zmian w różnorodności biologicznej oraz rosnącego ruchu turystycznego patogeny przenoszone przez komary, takie jak wirus Zachodniego Nilu, dengi, chikungunya i zika, rozprzestrzeniają się coraz dalej na północ. Z punktu widzenia zdrowia publicznego wymaga to stałego monitorowania populacji komarów, zanim dojdzie do wybuchu epidemii. W ramach programów nadzoru komary są zbierane w pułapkach, grupowane w tzw. pule (5–50 osobników na próbkę) i analizowane metodą RT-PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją) pod kątem obecności wirusowego RNA. Jakość przygotowania próbek ma decydujący wpływ na wiarygodność wyników. Szczególnie wirus Zachodniego Nilu i dengi zdobyły w ostatnich latach nowe obszary występowania w Europie – tendencja ta skłoniła organy ds. zdrowia na całym świecie do zintensyfikowania programów nadzoru. Im wcześniej uda się wykryć wirusa w populacji komarów, tym bardziej ukierunkowane działania zwalczające można podjąć, najlepiej jeszcze przed pojawieniem się przypadków zakażeń u ludzi. Dla laboratoriów nadzorujących oznacza to: tysiące próbek w sezonie, przetwarzanych pod ogromną presją czasową.

Jak działa regulacja temperatury w urządzeniu MM 500 control

Płyty termiczne przekazują ciepło bezpośrednio z misek mielących do czynnika chłodzącego. Miski mielące wystarczy po prostu umieścić na płytach termicznych, bez konieczności stosowania otwartych kąpieli z ciekłym azotem ani suchego lodu. Hermetycznie zamknięty układ płynów umożliwia pracę z wodą lub mieszaniną wody i glikolu (za pośrednictwem chłodziarki, od ok. 4 °C), z olejem termicznym w wyższych zakresach temperatur, a także z ciekłym azotem za pośrednictwem opcjonalnego modułu cryoPad dla temperatur do –100 °C. Dokładność regulacji systemu podczas pracy z ciekłym azotem zapewnia opatentowana metoda regulacji PID (proporcjonalno-całkująco-różniczkująca), która poprzez moduł cryoPad aktywnie ingeruje w strumień chłodzący. Temperaturę docelową można ustawić w krokach co 10 °C w zakresie od 100 do 0 °C i utrzymywać ją na stałym poziomie przez cały cykl mielenia. W praktyce sprawdziła się praca z chłodziarką do monitorowania komarów: dzięki wodzie schłodzonej do 4 °C zawiesina w 2-mililitrowych naczyniach reakcyjnych utrzymuje stałą temperaturę około 13 °C bez konieczności wykonywania jakiejkolwiek ręcznej przerwy na chłodzenie.

Większa wydajność analizy próbek: adapter do 18 probówek reakcyjnych o pojemności 2 ml

Specjalny aluminiowy adapter może pomieścić jednocześnie do 18 probówek Eppendorf (1,5 lub 2,0 ml). Aluminium skutecznie przenosi temperaturę z płyt grzewczych na probówki, dzięki czemu chłodzenie bez opóźnień dociera do próbek. Dzięki dwóm stacjom mielenia urządzenie MM 500 control przetwarza w ten sposób do 36 próbek w jednym cyklu.

W przypadku zastosowań, w których próbka musi zostać zamrożona lub poddana silnemu ogrzewaniu, firma Retsch zaleca stosowanie stalowych probówek o pojemności 2 ml zamiast polimerowych naczyń reakcyjnych, ponieważ lepiej wytrzymują one ekstremalne obciążenia mechaniczne i termiczne. Adapter aluminiowy może być używany z 9 stalowymi probówkami o pojemności 2 ml, co zapewnia maksymalną elastyczność w przypadku różnych materiałów próbnych i protokołów. Natomiast jednorazowe naczynia z tworzywa sztucznego idealnie nadają się do rutynowych operacji bez ryzyka zanieczyszczenia w ramach monitorowania komarów.

Wyzwanie: zachowanie integralności RNA podczas homogenizacji mechanicznej

RNA jest znacznie mniej stabilne niż DNA i niezwykle wrażliwe na ciepło, tarcie oraz enzymy RNA-azy. Konwencjonalne mechaniczne metody homogenizacji, np. z wykorzystaniem tradycyjnych młynów kulowych, generują podczas procesu ciepło tarcia, które może uszkodzić cząsteczki RNA, a nawet doprowadzić do ich całkowitej degradacji. Nawet krótki czas mielenia może podnieść temperaturę próbki o 10–20 °C i spowodować niejednolitą jakość próbek, jeśli przerwy na chłodzenie są przeprowadzane ręcznie i w sposób niejednolity. Ponadto tradycyjne metody chłodzenia, takie jak ręczne schładzanie adapterów w kąpieli lodowej, powodują przerwy w procesie, które jednocześnie negatywnie wpływają na powtarzalność wyników i przepustowość. W laboratoriach o wysokiej przepustowości, które w sezonie przetwarzają kilkaset próbek dziennie, przerwy te sumują się, powodując znaczną stratę czasu i obniżenie jakości. Laboratoria nadzorujące stoją zatem przed zasadniczym dylematem: zwiększyć przepustowość próbek czy zapewnić ich integralność – bez odpowiedniej technologii nie da się osiągnąć obu tych celów jednocześnie.

Większa wydajność przetwarzania próbek dzięki młynom wibracyjnym

Młyn wahadłowy MM 500 control to pierwszy na świecie młyn kulowy, który aktywnie monitoruje i reguluje temperaturę procesu mielenia. Dzięki podłączeniu do zewnętrznego urządzenia chłodzącego (np. agregatu chłodniczego) temperatura mielenia pozostaje pod stałą kontrolą przez cały czas trwania procesu, bez konieczności ręcznych przerw. Urządzenie zostało wyróżnione w 2022 r. nagrodą LABO jako produkt roku, co dodatkowo podkreśla znaczenie tej innowacji w technice laboratoryjnej. MM 500 control pracuje z częstotliwością do 30 Hz i osiąga końcową drobność około 0,1 µm przy maksymalnej wielkości wsadu wynoszącej 10 mm. Oprócz regulacji temperatury urządzenie przekonuje ergonomicznym mocowaniem miski mielącej, ekranem dotykowym z możliwością zapisania do 12 procedur operacyjnych (SOP), a także możliwością zapisania do czterech różnych programów cykli, z których każdy może być powtórzony 99 razy.

Praktyczne wskazówki i triki dotyczące przygotowywania próbek komarów

Optymalny protokół ekstrakcji RNA z pul komarów
 Próbki należy zamrozić na suchym lodzie lub w ciekłym azocie natychmiast po pobraniu, ponieważ degradacja RNA rozpoczyna się już w ciągu kilku minut w temperaturze pokojowej. W przypadku kubków do rozdrabniania i adapterów zaleca się schłodzenie ich przed umieszczeniem do temperatury 4 °C, aby od samego początku optymalnie wykorzystać wydajność chłodniczą systemu. Sprawdzone parametry rozdrabniania tkanek komarów to częstotliwość 25–28 Hz i czas rozdrabniania 45–60 sekund na cykl przy temperaturze wody chłodzącej wynoszącej 4 °C.

Urządzenie MM 500 control na bieżąco wyświetla temperaturę płyty termicznej na ekranie dotykowym, co pozwala w każdej chwili upewnić się, że temperatura zawiesiny nie przekracza 15 °C, a integralność RNA pozostaje zachowana. W przypadku tkanek komarów sprawdziły się kulki ze stali nierdzewnej o średnicy 2 lub 3 mm; w przypadku szczególnie wrażliwych zastosowań związanych z RNA można rozważyć zastosowanie kulek mielących z tlenku cyrkonu. Możliwość zapisania w urządzeniu do 12 procedur operacyjnych (SOP) zapewnia standaryzację procedur niezależnie od operatora oraz przez cały sezon.

Zapewnienie jakości w rutynowej pracy
 Zaleca się przeprowadzanie wyrywkowej kontroli jakości RNA na początku każdego sezonu oraz przy każdej zmianie protokołu, aby zweryfikować spójność procesu przygotowania w poszczególnych partiach. Jednorazowe naczynia reakcyjne (2 ml) całkowicie eliminują konieczność czyszczenia między partiami, co stanowi kluczową zaletę w przypadku nadzoru o wysokiej przepustowości, gdzie zanieczyszczenie krzyżowe między pulami jest niedopuszczalne.

Praktyczne przykłady zastosowań

Próbki biologiczne – rozdrabnianie komórek i homogenizacja tkanek
 Oprócz monitorowania komarów urządzenie MM 500 control sprawdza się w szerokim spektrum zastosowań biologicznych – wszędzie tam, gdzie na pierwszym planie znajdują się cząsteczki wrażliwe na temperaturę oraz powtarzalne wyniki. W wirusologii i mikrobiologii urządzenie to wykorzystuje się do ekstrakcji RNA z próbek tkankowych, osadów komórkowych i organoidów; w badaniach farmaceutycznych – do homogenizacji tabletek, kapsułek i matryc biologicznych w kontrolowanej temperaturze. Mielenie kriogeniczne lotnych substancji aromatycznych, np. ziaren kawy w temperaturze –20 °C, jest przykładem z zakresu analizy żywności, który podkreśla szeroki zakres możliwości zastosowań.

Dla laboratoriów zajmujących się nadzorem epidemiologicznym, które codziennie przetwarzają setki, a nawet tysiące próbek komarów, młyn wibracyjny Retsch Mill MM 500 control stanowi decydujący krok w kierunku wyższej jakości danych i wydajności procesów. Aktywna regulacja temperatury chroni integralność RNA, zwiększa powtarzalność wyników między partiami oraz eliminuje czasochłonne ręczne przerwy na chłodzenie. W porównaniu z konwencjonalnymi młynami kulowymi bez regulacji temperatury model MM 500 control oferuje trzy kluczowe zalety: po pierwsze bezpośrednie, ciągłe chłodzenie bez przerywania procesu; po drugie, możliwość pełnego protokołowania i zapisywania standardowych procedur operacyjnych (SOP) dla środowisk laboratoryjnych zgodnych z GLP; po trzecie, elastyczność w zakresie zmiany czynników chłodzących w zależności od wymagań, od prostego agregatu chłodniczego po ciekły azot z opcjonalnym modułem cryoPad.