Jonizacja DBDI jako pomost między GC a LC-MS Analiza pestycydów bez kompromisów: 687 pestycydów w 15 minut

Klasyczne metody GC-MS napotykają ograniczenia w przypadku złożonych matryc i coraz dłuższych list związków. Źródło jonów oparte na technologii DBDI generuje nienaruszone jony molekularne zamiast fragmentów, otwierając tym samym drogę do prostszych procesów analitycznych, potwierdzania metodą MS/MS oraz wspólnych bibliotek widm z wykorzystaniem LC-MS/MS.

Chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią masową (GC-MS) od dziesięcioleci stanowi standardową metodę analizy pozostałości pestycydów. Jej zalety są dobrze znane: wysoka wydajność rozdzielania, powtarzalność, niezawodna kwantyfikacja oraz obszerna baza danych dzięki ugruntowanym bibliotekom widm. Rzadziej porusza się jednak kwestię tego, co systematycznie uniemożliwia dominująca metoda jonizacji – jonizacja przez zderzenie z elektronami (EI).

Gdy widma fragmentacyjne przestają wystarczać

W jonizacji EI cząsteczki analitu są poddawane działaniu wysokoenergetycznych elektronów. Skutkiem tego jest ekstensywna fragmentacja: nienaruszony jon cząsteczkowy ulega zniszczeniu, pozostawiając wzór składający się z 10 do 20 pików fragmentacyjnych w niskim zakresie mas. W przypadku czystych matryc o wysokich stężeniach jest to wystarczające. W rzeczywistych próbkach, takich jak na przykład ekstrakty spożywcze, matryce środowiskowe czy złożone materiały rolnicze, te jony fragmentacyjne konkurują z sygnałami matrycy w tych samych zakresach spektralnych.

Konsekwencje: większy nakład pracy przy ręcznej analizie w trakcie identyfikacji pików, ograniczona selektywność w przypadku stężeń śladowych zbliżonych do maksymalnego limitu pozostałości (MRL). Sytuację dodatkowo komplikuje fakt, że przepisy regulacyjne dotyczące niektórych substancji wymagają co najmniej dwóch punktów identyfikacyjnych – w przypadku GC-EI, oprócz chromatogramu, zazwyczaj poprzez charakterystyczne jony fragmentacyjne w trybie monitorowania wybranych jonów (SIM). Jeśli tryb SIM nie jest możliwy lub nie daje jednoznacznych wyników, konieczne jest przeprowadzenie drugiego cyklu pomiarowego na platformie LC-MS/MS (chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią masową): wraz z ponownym, często skomplikowanym przygotowaniem próbki – a w przypadku analitów lotnych lub termolabilnych czasami bez użytecznego wyniku, ponieważ po prostu nie da się ich zjonizować w warunkach jonizacji elektrospryskowej (ESI), które zwykle towarzyszą LC-MS.

Wynik: dwa odrębne ekosystemy urządzeń, dwa formaty bibliotek spektralnych i dwa procesy tworzenia metod – co wiąże się z podwójnym nakładem pracy w zakresie zakupów, konserwacji i szkoleń.

Jonizacja łagodna jako pomost między GC a LC

Właśnie w tym miejscu do akcji wkracza źródło jonów oparte na technologii DBDI. Skrót DBDI oznacza wyładowanie barierowe dielektryczne – zasadę jonizacji, która powoduje łagodną jonizację analitów, a tym samym ogranicza ich fragmentację. W rezultacie uzyskuje się widma, w których dominują nienaruszone jony molekularne i kwazimolekularne: głównie [M+H]⁺ i [M]⁺. Podczas gdy w trybie EI intensywność sygnału rozkłada się na 10 do 20 pików fragmentacyjnych, źródło jonów DBDI koncentruje sygnał w jednym lub dwóch dominujących rodzajach jonów.

Firma Plasmion wprowadziła tę technologię na rynek pod nazwą Sicrit. Kluczowa zaleta architektury: dzięki dedykowanym modułom sprzęgającym to samo źródło jonów może dowolnie łączyć separację GC lub LC z tym samym spektrometrem masowym. Pomiary GC i LC nadal odbywają się jako oddzielne cykle, ale wykorzystują tę samą chemię jonową, tę samą bibliotekę widm oraz ten sam proces weryfikacji. Ponadto źródło jonów może jonizować zarówno składniki polarne, jak i niepolarne, co w pewnym stopniu znosi tradycyjne ograniczenie między analityką opartą na GC a LC. Rozwiązanie to nie jest przywiązane do konkretnego producenta sprzętu, lecz można je łączyć ze wszystkimi dostępnymi na rynku systemami chromatograficznymi (GC, LC, SFC) oraz spektrometrem masowym działającym przy ciśnieniu atmosferycznym.

Regulacyjne granice wykrywalności w trybie pełnego skanowania

Fakt, że źródło jonów dostarcza nienaruszone jony cząsteczkowe i można je łączyć z obiema platformami rozdzielczymi, stanowi podstawę techniczną – jednak kluczową kwestią dla zastosowań laboratoryjnych jest pytanie: czy czułość jest wystarczająca, aby osiągnąć granice wykrywalności (LOD) istotne z punktu widzenia przepisów? Wartości LOD dla pestycydów muszą osiągać lub być niższe od standardowej wartości maksymalnej UE wynoszącej 10 ppb, najlepiej bez konieczności stosowania ukierunkowanych trybów akwizycji, takich jak SIM lub Multiple Reaction Monitoring (MRM).

W badaniu przeprowadzonym z wykorzystaniem układu GC-DBDI-LC-QTOF przeanalizowano 74 pestycydy pochodzące z trzech wzorców wieloresztkowych w pięciopunktowym zakresie kalibracji od 1 ppb do 1 ppm. Wartości LOD obliczono zgodnie z metodologią Komisji Europejskiej (3,9 × Sb / nachylenie; Sb = odchylenie standardowe). Wszystkie pomiary przeprowadzono w trybie Full-Scan-MS¹ – bez SIM, bez MRM, bez optymalizacji specyficznej dla poszczególnych związków.

Wynik: 70 z 74 związków osiągnęło wartości LOD poniżej maksymalnego poziomu określonego w normie UE, wynoszącego 10 ppb. Krzywe kalibracyjne wykazały wysoką liniowość dla wszystkich trzech standardów. Osiągnięcie istotnych z punktu widzenia przepisów granic wykrywalności w trybie pełnego skanowania bez ukierunkowania nie jest sprawą trywialną: świadczy to o potencjale optymalizacji tej metody pod kątem ukierunkowanego zastosowania z innymi trybami (SIM, MRM) lub ogólnie w systemach z potrójnym kwadrupolami (MRM).

Potwierdzenie metodą MS/MS bezpośrednio na podstawie wyników analizy GC

Odpowiednia czułość jest jednym z warunków stosowania w celach regulacyjnych – drugim jest bezsprzeczna identyfikacja trafienia. Właśnie w tym miejscu ujawnia się kolejna zaleta nienaruszonych jonów prekursorowych: Dzięki dominującemu jonowi prekursorowemu [M+H]⁺ proces potwierdzania ulega znacznemu uproszczeniu. Akwizycja zależna od danych (DDA) może automatycznie wyzwalać fragmentację wywołaną zderzeniami (CID) dla związków będących przedmiotem zainteresowania. Powstałe w ten sposób widma MS² pochodzą z jasno zdefiniowanego jonu prekursorowego przy kontrolowanych energiach zderzeń – jest to ta sama struktura eksperymentalna, co w przypadku potwierdzania metodą LC-MS/MS.

Ponieważ wytworzone jony prekursorowe są chemicznie równoważne z jonami wytworzonymi w metodzie ESI, widma MS² uzyskane w ramach akwizycji GC-DBDI można bezpośrednio porównać z istniejącymi bibliotekami widm LC-MS/MS – bez konieczności tłumaczenia lub dostosowywania. Na przykład w przypadku diazynonu widmo MS² jako najlepszy wynik pokrywało się z wpisem w bibliotece Shimadzu LC-MS/MS.

Zabezpieczenie pomieszczenia chemicznego

Po wykazaniu czułości i zdolności potwierdzania na mniejszym zbiorze związków pojawiło się pytanie, w jakim stopniu można skalować to podejście – oraz jaką część istotnej przestrzeni związków może w ogóle objąć pojedyncza metoda. Metody GC i LC tradycyjnie dzieliły tę przestrzeń według właściwości chemicznych: lotne i półlotne związki niepolarne do GC, polarne i termolabilne do LC. Wiele wykazów pestycydów zawiera związki z obu tych obszarów – a żadna konwencjonalna pojedyncza platforma nie obejmuje ich wszystkich.

Kwestia ta została zbadana m.in. w ramach badania przeprowadzonego w ramach projektu doktoranckiego na Politechnice w Monachium z wykorzystaniem tej samej konfiguracji GC-DBDI-LC-QTOF. W ramach badania przeanalizowano 687 pestycydów – zarówno z klas związków nadających się do GC, jak i do LC – z których już w pierwszym eksperymencie, bez optymalizacji, udało się wykryć 99,1%. Warto zauważyć, że nawet związki klasycznie nadające się do LC zostały zmierzone za pomocą separacji GC bez żadnej derywatyzacji – było to możliwe, ponieważ jonizacja DBDI nie ogranicza się do analitów polarnych lub niepolarnych. Liniowy zakres dynamiczny przekroczył trzy rzędy wielkości, a czułość spełniała unijne wartości progowe MRL dla wszystkich wykrytych związków. Zastosowanie wodoru zamiast helu jako gazu nośnego skróciło czas analizy o około 40% do 15 minut – przy zachowaniu tej samej rozdzielczości chromatograficznej i bez negatywnego wpływu na wydajność spektrometru masowego (MS) lub jakość widm.

Co to oznacza w codziennej pracy laboratoryjnej

Korzyści analityczne mają bezpośredni wymiar infrastrukturalny. Tradycyjne laboratorium, które wykorzystuje GC-MS i LC-MS jako odrębne platformy, utrzymuje dwa niezależne ekosystemy urządzeń: dwa spektrometry masowe, dwa źródła jonizacji, dwa formaty bibliotek spektralnych oraz dwa procesy opracowywania metod.

Dzięki wspólnemu źródłu jonów dla GC i LC obie metody rozdzielania wykorzystują tę samą chemię jonową, tę samą bibliotekę widm oraz ten sam proces weryfikacji. Nie oznacza to jednak, że metody GC-EI i LC-ESI staną się przestarzałe – nadal będą istnieć zastosowania wymagające konkretnych wzorów fragmentacji EI do identyfikacji lub ESI w przypadku związków, które nie nadają się do separacji metodą GC. Powstaje natomiast nowa, trzecia kategoria: zastosowania, w których jedna metoda jonizacji obejmuje oba obszary związków na jednolitej platformie MS.

Właśnie w przypadku tej trzeciej kategorii nakłady związane z infrastrukturą i procesami, opisane na początku, ulegają zauważalnemu zmniejszeniu: jedna platforma sprzętowa zamiast dwóch, wspólna biblioteka widm, mniej powtarzających się prac nad opracowywaniem metod oraz mniejsze nakłady na konserwację i szkolenia.

Podsumowanie

Jonizacja miękka w połączeniu z GC nie tylko zmienia jakość widm – stwarza ona również warunki do zasadniczo odmiennego przebiegu analizy. Źródło jonów oparte na technologii DBDI generuje widma, w których dominują nienaruszone jony cząsteczkowe i kwazimolekularne, a granice wykrywalności przewyższają nawet te osiągane w dotychczasowych metodach GC-MS dla wielu substancji, oraz umożliwia potwierdzenie wyników metodą MS/MS poprzez bezpośrednie porównanie z bibliotekami LC-MS/MS. Dla laboratoriów, które dotychczas traktowały GC-MS i LC-MS jako odrębne dziedziny, technologia DBDI otwiera zatem drogę do zniesienia tej granicy bez rezygnacji z analitycznej dokładności którejkolwiek z tych metod.