Porady HILIC, część 5 Prawidłowe ustawienie soli w mobilnej fazie HILIC

Dodanie soli do ruchomej fazy HILIC poprawia powtarzalność wyników i kształt pików, a tym samym optymalizuje jakość rozdzielania. Ale które sole nadają się do tego najlepiej? Jak można je niezawodnie rozpuścić w fazach ruchomych o wysokiej zawartości acetonitrylu? I jaki wpływ mają sole na proces rozdzielania?

Zazwyczaj do fazy ruchomej dodaje się sole, aby móc kontrolować oddziaływania elektrostatyczne między naładowanymi analitami a fazą stacjonarną. Poprawia to kształt pików eluujących analitów poprzez zmniejszenie rozmycia pików. Należy przy tym zwrócić uwagę na kilka kwestii.

Sole odpowiednie do metody HILIC

Zazwyczaj w metodzie HILIC stosuje się sole takie jak octan amonu i formian amonu, a czasami także wodorowęglan amonu (patrz rys. 2). Co ciekawe, sole te rozpuszczają się również w mieszaninach rozpuszczalników o wysokiej zawartości acetonitrylu, co jest typowe dla HILIC na początku analizy. Jednocześnie sole te, ze względu na swoją lotność, są kompatybilne z następującą po nich detekcją spektrometryczną masową, która stanowi często stosowaną technikę detekcji w metodzie HILIC. W miarę możliwości należy unikać stosowania soli mniej rozpuszczalnych, takich jak fosforany, lub odczynników tworzących pary jonowe, takich jak TFA, o ile planowana jest detekcja MS. Jeśli jednak stosuje się detektory spektroskopowe, można z powodzeniem wykorzystać sole „nielotne”. Substancje takie wykazują w większym stopniu tzw. efekty wysalania i mogą wywierać działanie kosmotropowe oraz chaotropowe na cząsteczki naładowane, czyli wzmacniać lub zakłócać wiązania wodorowe [1]. Omówienie tego zagadnienia wykraczałoby jednak w tym miejscu poza ramy niniejszego artykułu i można je znaleźć w pracach Andrew J. Alperta.

Większość faz ruchomych HILIC wytwarza się zatem poprzez dodanie octanu amonu lub mrówczanu amonu. Obie te sole nie mają identycznego zastosowania, ponieważ mrówczan amonu powoduje, że pH fazy ruchomej jest bardziej kwaśne niż w przypadku octanu amonu.

Mieszanka obu soli pozwala precyzyjnie regulować wartość pH fazy ruchomej w określonym zakresie.

Wpływ zawartości soli

Ogólny wpływ zawartości soli w fazie ruchomej można opisać w następujący sposób: Sole wpływają na oddziaływania elektrostatyczne cząsteczek naładowanych z naładowanymi lub dwukationowymi materiałami kolumnowymi (zob. Wskazówka HILIC nr 3). W przypadku przyciągania elektrostatycznego między analitami a fazą stacjonarną obowiązuje następująca zasada: wzrost zawartości soli prowadzi do zmniejszenia retencji.

W związku z tym w przypadku odpychania elektrostatycznego między analitami a fazą stacjonarną obowiązuje zasada odwrotna: wzrost zawartości soli prowadzi do zwiększonej retencji danego analitu.

Drugim skutkiem zastosowania soli lub zwiększenia zawartości soli w fazie ruchomej jest grubość warstwy wody na powierzchni polarnych materiałów HILIC. Wysoka zawartość organicznego eluentu w fazie ruchomej na początku rozdzielania powoduje, że sól gromadzi się przede wszystkim w warstwie wodnej. Rosnące stężenie soli prowadzi zatem do zwiększania się grubości warstwy wodnej, co zasadniczo wiąże się z większą retencją wszystkich analitów polarnych (wyjątek – patrz wyżej). Dlatego też znaczna zawartość soli prowadzi do zwiększonej retencji również w przypadku polarnych, nie naładowanych analitów, nawet jeśli nie są one w stanie wytworzyć oddziaływania elektrostatycznego. Schemat wyjaśniający ten proces przedstawiono na rysunku 2. Prace leżące u podstaw tych rozważań zostały przez nas przeprowadzone już około 15 lat temu w fazie ZIC-HILIC i opublikowane w artykule [2].

Przygotowanie fazy ruchomej

Aby zapewnić wystarczającą powtarzalność retencji i kształtu piku, konieczne jest uzyskanie w fazie ruchomej końcowego stężenia soli wynoszącego co najmniej 5 mmol/l oraz utrzymanie tego stężenia w stanie trwałej stabilności. Wpływ gradientu solnego omówiliśmy już w innym miejscu i nie będziemy go tutaj uwzględniać [3]. Rozpuszczalność soli w fazie ruchomej o wysokiej zawartości rozpuszczalnika organicznego może jednak okazać się problematyczna i często prowadzi do wytrącania się soli w roztworze.

W przypadku faz mobilnych o zawartości acetonitrylu wynoszącej 95 % stężenie soli należy początkowo utrzymywać poniżej 15 mmol/l ze względu na ograniczoną rozpuszczalność.

Tradycyjną procedurę przygotowania faz ruchomych do HILIC przedstawiono na rysunku 3. Jako przykład przygotujemy 1 l fazy ruchomej składającej się z acetonitrylu i wody (95:5, v/v) o końcowym stężeniu octanu amonu wynoszącym 10 mmol/l. Kluczowe znaczenie ma tutaj całkowite rozpuszczenie octanu amonu w czystej wodzie. W tym celu przygotowuje się najpierw 50 ml wodnego roztworu octanu amonu o stężeniu 200 mmol/l. Wystarczy zwykłe mieszanie, aby sól całkowicie rozpuściła się w wodzie w ciągu kilku sekund. Następnie, przy ciągłym mieszaniu, do 50 ml wodnego roztworu octanu amonu powoli dodaje się 950 ml acetonitrylu. W ten sposób otrzymuje się 1 l fazy ruchomej o stosunku acetonitrylu do wody wynoszącym 95:5 (v/v) i końcowym stężeniu octanu amonu wynoszącym 10 mmol/l.

W gotowym roztworze mogą teraz pojawić się na dnie butelki mętne, małe kuleczki. Świadczy to o niepełnym rozpuszczeniu soli w fazie ruchomej. Zastosowanie przezroczystych butelek szklanych może pomóc w monitorowaniu tego zjawiska. Energiczne mieszanie, nawet przez całą noc, nie poprawi rozpuszczalności soli. Aby jednak całkowicie rozpuścić sól, należy poddać butelkę z roztworem działaniu kąpieli ultradźwiękowej do momentu, aż roztwór stanie się przezroczysty, a kropelki lub cząsteczki znikną. Zazwyczaj 30-minutowe działanie ultradźwięków jest całkowicie wystarczające.

Gdy sól całkowicie się rozpuści, fazę ruchomą można przefiltrować w zwykły sposób, a następnie od razu wykorzystać do analizy chromatograficznej. Procedurę tę można zastosować również w przypadku innych faz ruchomych HILIC oraz w razie potrzeby zmodyfikować. Zawartość wody, rodzaj soli i stężenie soli można przy tym precyzyjnie dostosować do danego zastosowania. Ważna jest również powtarzalność obróbki ultradźwiękowej. W szczególności intensywność i czas trwania naświetlania ultradźwiękami powinny być zawsze utrzymywane na stałym poziomie.

Wpływ zawartości soli

Oprócz wpływu na oddziaływania elektrostatyczne stężenie soli wpływa na grubość warstwy wodnej, co z kolei wpływa na retencję związków nieuzładowanych. Wysoki procent rozpuszczalnika organicznego w eluencie powoduje, że sól jest preferencyjnie wypierana do warstwy wodnej. Zwiększenie stężenia soli prowadzi zatem konsekwentnie do pogrubienia warstwy wodnej. Ten podwójny efekt stężenia soli można zaobserwować w niektórych procesach rozdzielania. Przykład:

Rozdzielanie kwasu 2-hydroksybenzoesowego i kwasu 4-hydroksybenzoesowego (2-HB i 4-HB; oznaczone na rysunku 4 jako nr 1 i nr 2) na trzech kolumnach o różnych właściwościach (jak pokazano na rysunku 4 i zaczerpnięto z oryginału [3]). Przy neutralnym pH oba anality znajdują się w stanie ujemnie naładowanym w wyniku deprotonowania grupy karboksylowej. Zwiększenie stężenia octanu amonu z 10 mM do 15 mM przy stałym udziale 90% acetonitrylu w fazie ruchomej powoduje w przypadku 4-HB znaczne wzmocnienie jego wiązania z neutralną kolumną diolową oraz dłuższy czas retencji.

Uwaga: 2-HB zawiera wewnątrzcząsteczkowe wiązanie wodorowe między grupą karboksylową a hydroksylową [5], przez co cząsteczka ta zachowuje się w chromatografii jako bardzo „niepolarna” (podobnie jak np. toluen) i w związku z tym nie ulega spowolnieniu na neutralnej kolumnie HILIC.

Wracając do separacji polarnej: wyraźnie zwiększona retencja przy wyższym stężeniu soli, spowodowana grubszą warstwą wody, jest wyraźnie widoczna w przypadku 4-HB, zwłaszcza w fazach neutralnych.

Wpływ stężenia soli na retencję przypisuje się ponadto efektowi wysalania [1]. W tym przypadku cząsteczki wody są w większym stopniu wiązane w celu solwatacji jonów soli, co powoduje zmniejszenie solwatacji analitów i może sprzyjać ich bezpośrednim oddziaływaniom z fazą stacjonarną. W przypadku fazy amino o ładunku dodatnim można zaobserwować przyciąganie elektrostatyczne z obiema cząsteczkami, tj. z anionowymi 2-HB i 4-HB (w przypadku tej ostatniej znacznie bardziej wyraźne ze względu na hydrofilowość). Wzrost stężenia soli powoduje spadek przyciągania elektrostatycznego, co skutkuje zmniejszeniem retencji.

Jak już wspomniano, w przypadku faz stacjonarnych o charakterze amfoterycznym wewnętrzna grupa kationowa powoduje przyciąganie elektrostatyczne ujemnie naładowanych analitów, takich jak 2-HB i 4-HB. Jednocześnie anality te doświadczają odpychania elektrostatycznego ze strony zewnętrznej grupy anionowej fazy stacjonarnej. Nie dominują one jednak, ponieważ głównym efektem nie jest tutaj oddziaływanie elektrostatyczne, lecz przede wszystkim zwiększona grubość warstwy wodnej przy podwyższonym stężeniu soli.

W kolejnej poradzie HILIC zajmiemy się łącznym działaniem substancji organicznych i soli.

Bibliografia

[1] A.J. Alpert: Wpływ soli na retencję w chromatografii interakcji hydrofilowych. Journal of Chromatography A 2018, 1538, 45–53

[2] G. Greco, S. Grosse i T. Letzel: Badanie zachowania retencyjnego izomerów kwasów hydroksy- i aminobenzoesowych w chromatografii interakcji hydrofilowych z użyciem związków dwufunkcyjnych. Journal of Chromatography A 2012, 1235, 60–67.

[3] T. Letzel: Specyfikacje gradientów w chromatografii cieczowej opartej na oddziaływaniach hydrofilowych (HILIC). W: Gradient HPLC dla praktyków: RP, LC-MS, analityka jonowa, biochromatografia, SFC, HILIC. Stavros Kromidas (red.) Wiley-VCH; ISBN-10: 352734408X; wydanie pierwsze (17 kwietnia 2019 r.), s. 175–182

[4] G. Greco i T. Letzel: Główne interakcje i wpływ parametrów chromatograficznych w separacjach metodą HILIC. Journal of Chromatographic Science, 2013, 51 (7), 684–693.

[5] S. Grosse i T. Letzel: Chromatografia cieczowa / spektrometria masowa z jonizacją w ciśnieniu atmosferycznym z mieszaniem cieczy po kolumnie w celu skutecznego oznaczania częściowo utlenionych wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych. Journal of Chromatography A 2007, 1139, 75–83.

Zobacz inne porady HILIC

Autorzy

Dr Thomas Letzel: założyciel i dyrektor zarządzający, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS), www.afin-ts.de

Thomas Letzel ukończył szkolenie na technika laboratoryjnego w dziedzinie chemii, a następnie studiował chemię i uzyskał stopień doktora w dziedzinie analityki środowiskowej. Następnie odbył staże badawcze w Amsterdamie i Monachium (na Uniwersytecie Technicznym w Monachium (TUM), gdzie od 2009 roku wykłada również jako prywatny wykładowca w zakresie „chemii analitycznej i bioanalizy”). Od 2018 roku prowadzi badania i doradztwo (w ramach trójki założycieli) w ramach własnego instytutu badawczego, a jego celem jest szersze wprowadzenie metody HILIC jako techniki HPLC do codziennej praktyki analitycznej.

Dr Stefan Bieber: założyciel i dyrektor zarządzający, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS)

Wraz z Thomasem Letzelem Stefan Bieber kieruje spółką AFIN-TS GmbH jako dyrektor zarządzający i od wielu lat zajmuje się badaniami przesiewowymi metodą non-target.


.

Dr Annette Dibowski:Dyrektor zarządzająca, Dichrom GmbH, www.dichrom.com

Annette Dibowski jest nie tylko dyrektorką zarządzającą firmy Dichrom i konsultantką ds. sprzedaży w Biotech Fluidics, ale także zapaloną „badaczką polarności” w dziedzinie chromatografii związków polarnych.