Zautomatyzowana mikrofluidyka Łatwiejszy dostęp do obrazowania w wysokiej rozdzielczości wielu struktur komórkowych

Mikroskopia superrozdzielcza pozwala uwidocznić układy cząsteczek z nanometrową precyzją. Złożone eksperymenty wielokanałowe nadal jednak wymagają wielu godzin pracy ręcznej. Zautomatyzowana mikrofluidyka upraszcza te procesy, zwiększa powtarzalność wyników i toruje drogę do inteligentnej mikroskopii.

Przez dziesięciolecia jednym z najważniejszych celów mikroskopii było osiąganie coraz wyższej rozdzielczości przestrzennej. Współczesna mikroskopia superrozdzielcza (SRM) przesunęła tę granicę do około dziesięciu nanometrów. Dzięki temu można uwidocznić struktury w nanoskali oraz organizację białek, których nie da się rozróżnić za pomocą konwencjonalnej mikroskopii świetlnej.

Od wyższej rozdzielczości do większej ilości informacji biologicznej

Systemy biologiczne są jednak złożone. Komórka zawiera liczne organelle i struktury, które oddziałują ze sobą. Ich organizacja przestrzenna jest ściśle powiązana z funkcją komórki. Dlatego też naukowcy dążą obecnie nie tylko do uzyskania jak najostrzejszych obrazów poszczególnych struktur, ale także do zbadania jak największej liczby elementów komórki lub tkanki w kontekście ich wzajemnych relacji przestrzennych.

Mikroskopia superrozdzielczościowa z wykorzystaniem multipleksowania stała się zatem ważnym narzędziem współczesnego obrazowania biologicznego. Jednocześnie pojawia się jednak praktyczne wyzwanie: im więcej informacji ma zostać uzyskanych z próbki, tym bardziej złożone stają się procedury eksperymentalne – i tym trudniej jest je przeprowadzić ręcznie.

DNA-PAINT umożliwia wielokanałowość molekularną

W konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej wielobarwnej różne struktury są znakowane fluoroforami o różnych barwach. W praktyce jednak można niezawodnie odróżnić od siebie tylko ograniczoną liczbę struktur docelowych. 

Metoda DNA-PAINT opiera się na innym podejściu: krótkie sekwencje DNA kodują tożsamość różnych cząsteczek docelowych. Komplementarne sondy DNA znakowane fluorescencyjnie generują następnie sygnały niezbędne do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Kluczowe znaczenie ma to, że różne struktury docelowe można obrazować kolejno przy użyciu tego samego barwnika fluorescencyjnego. Pozwala to ominąć wiele ograniczeń związanych z konwencjonalną mikroskopią wielobarwną.

W tak zwanej metodzie Exchange-PAINT fluorescencyjne sondy DNA są kolejno wprowadzane do próbki, a następnie z niej usuwane. W ten sposób można sukcesywnie uwidocznić liczne struktury w obrębie tej samej próbki biologicznej. Metoda ta zapewnia zatem dużą elastyczność w przypadku eksperymentów wielokrotnych – jednak wraz ze wzrostem liczby badanych struktur docelowych jej praktyczne zastosowanie staje się coraz bardziej pracochłonne.

Praca ręczna staje się wąskim gardłem

Każda runda obrazowania metodą Exchange-PAINT obejmuje dodanie sond DNA, wykonanie zdjęcia oraz kilka etapów płukania. Eksperyment multipleksowy wymaga zatem licznych zmian roztworów i trwa zazwyczaj kilka godzin.

Jeśli czynności te są wykonywane ręcznie, wymagają one ciągłej uwagi. Różnice w pipetowaniu, płukaniu lub czasach inkubacji mogą wpływać na powtarzalność wyników, a ostatecznie także na jakość obrazu. Jednocześnie ręczne wykonywanie tych czynności ogranicza przepustowość próbek.

Widać tu zasadnicze wyzwanie związane ze współczesną mikroskopią: podczas gdy technologie obrazowania stają się coraz bardziej wydajne, wiele procedur eksperymentalnych nadal opiera się na ręcznej obsłudze próbek. Ich automatyzacja może zatem być równie ważna jak dalszy rozwój samego mikroskopu.

Mikrofluidyka automatyzuje proces obrazowania

Aby wyeliminować to wąskie gardło, opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę mikrofluidyczną do mikroskopii wielokanałowej o superrozdzielczości.

Zamiast ręcznej wymiany rozwiązań obrazujących, różne odczynniki są doprowadzane przez oddzielne kanały przepływowe i wprowadzane do komory próbki pod kontrolą oprogramowania. Delikatne sterowanie sprężonym powietrzem umożliwia szybką i powtarzalną wymianę roztworu przy jednoczesnym minimalnym obciążeniu próbki i niskim zużyciu odczynników.

Zamiast ręcznej wymiany rozwiązań do obrazowania, różne odczynniki są doprowadzane przez oddzielne kanały przepływowe i wprowadzane do komory próbki pod kontrolą oprogramowania. Delikatne sterowanie sprężonym powietrzem umożliwia szybką i powtarzalną wymianę roztworu przy jednoczesnym niewielkim obciążeniu próbki i niskim zużyciu odczynników.

System został celowo zaprojektowany jako modułowy system dodatkowy i można go łączyć z istniejącymi platformami mikroskopowymi. W razie potrzeby, w celu przeprowadzenia bardziej złożonych eksperymentów, można w prosty sposób dodać dodatkowe kanały przepływowe.

W codziennej pracy laboratoryjnej daje to wyraźne korzyści: większą powtarzalność, mniej pracy ręcznej, mniejsze zużycie odczynników oraz większą przepustowość próbek. Przede wszystkim złożone protokoły obrazowania mogą być realizowane w sposób znormalizowany, bez konieczności ręcznego wykonywania każdego pojedynczego etapu.

Szczególne wyzwanie: wrażliwe komórki mięśnia sercowego

Zalety kontrolowanego podawania płynów są szczególnie widoczne w przypadku wrażliwych próbek biologicznych.

Pierwotne kardiomiocyty to duże komórki mięśnia sercowego, które czasami przylegają jedynie słabo do powierzchni komory próbki. Wielokrotne ręczne płukanie może powodować obciążenie mechaniczne komórek, a nawet ich odrywanie się od powierzchni. Jednak w przypadku obrazowania wielokrotnego ta sama komórka musi pozostać stabilna przez kilka kolejnych cykli obrazowania.

Platforma mikrofluidyczna wytwarza precyzyjnie kontrolowany i delikatny przepływ cieczy. Dzięki temu roztwory DNA-PAINT można było wielokrotnie wymieniać bez uszkadzania kardiomiocytów w trakcie eksperymentu.

Dzięki temu podejściu udało się zobrazować pięć różnych struktur docelowych w obrębie poszczególnych kardiomiocytów. Uzyskane w ten sposób obrazy o superrozdzielczości pokazują szczegółowy układ białek związanych z błoną w skali nano w obrębie tej samej komórki. Jednocześnie wyniki te wskazują, że zautomatyzowana mikrofluidyka umożliwia wykonywanie złożonych obrazów wielokanałowych nawet w przypadku wrażliwych próbek biologicznych.

Od zautomatyzowanej fluidyki do zautomatyzowanej mikroskopii

Możliwości automatyzacji mikroprzepływowej wykraczają znacznie poza stosowanie sond DNA.

Ponieważ system działa w oparciu o oprogramowanie, zmiana roztworu może zostać bezpośrednio zintegrowana z procesem rejestracji obrazu. Mikroskop mógłby najpierw zarejestrować pierwszą strukturę znakowaną fluorescencyjnie, a następnie automatycznie przeprowadzić procesy płukania i wymianę sondy DNA, po czym kontynuować rejestrację obrazu.

W ten sposób można zautomatyzować nie tylko pojedynczy etap pracy, ale w perspektywie długoterminowej cały przebieg eksperymentu. Złożone eksperymenty, które obecnie wymagają ciągłego nadzoru ze strony doświadczonych użytkowników, mogłyby przebiegać zgodnie ze standardowymi protokołami przy minimalnej interwencji ręcznej. Dzięki temu mikroskopia superrozdzielcza z wielokrotnym obrazowaniem mogłaby stać się łatwiej dostępna również dla osób niebędących specjalistami, ośrodków obrazowania (Imaging Core Facilities) oraz w ramach większych badań.

Kolejnym krokiem jest nie tylko automatyzacja takich procesów, ale także nadanie im charakteru adaptacyjnego. Informacje obrazowe uzyskane podczas eksperymentu mogłyby zostać przeanalizowane przez oprogramowanie i wykorzystane do określenia kolejnego etapu eksperymentu – na przykład dostosowania parametrów rejestracji, wyboru nowego obszaru obrazu lub celowej wymiany roztworu.

W kierunku inteligentnej mikroskopii

Obiecującą platformą dla takich procesów roboczych jest modułowy mikroskop z płaską wiązką światła Flamingo.

Flamingo zostało zaprojektowane jako przenośna platforma obrazowania, której układ optyczny, sprzęt i oprogramowanie można dostosować do różnych wymagań eksperymentalnych. Dzięki temu modułowa architektura stanowi odpowiednią podstawę do połączenia zautomatyzowanego systemu przepływowego z rejestracją obrazu i adaptacyjnymi protokołami mikroskopowymi.

Długoterminową wizją jest inteligentny mikroskop, w którym obrazowanie, manipulacja próbkami i analiza danych nie będą już przebiegać jako oddzielne etapy. Zamiast tego informacje uzyskane podczas rejestracji obrazu mogłyby sterować eksperymentem w czasie rzeczywistym – na przykład poprzez wybór odpowiednich obszarów obrazu, dostosowanie parametrów rejestracji lub zainicjowanie zmiany roztworu.

Mikrofluidyka odgrywa tu ważną rolę: pozwala mikroskopowi nie tylko obserwować próbkę, ale także celowo oddziaływać na nią i precyzyjnie kontrolować jej otoczenie.

Automatyzacja wykraczająca poza mikroskopię

Te same zasady można zastosować również poza zakresem mikroskopii fluorescencyjnej z multiplexowaniem. Eksperymenty w dziedzinie nanotechnologii DNA i samoorganizacji molekularnej często wymagają precyzyjnego pod względem czasowym dodawania i usuwania składników molekularnych. Zautomatyzowana mikrofluidyka może przejąć tę kontrolę, jednocześnie zmniejszając zużycie odczynników i zwiększając powtarzalność wyników.

Podobne koncepcje mogłyby również okazać się interesujące w przypadku nowych podejść eksperymentalnych na styku nanotechnologii i nauk kwantowych, w których ważną rolę odgrywają precyzyjnie kontrolowane środowiska chemiczne oraz zautomatyzowane procedury eksperymentalne.

Zautomatyzowana mikrofluidyka jest zatem czymś znacznie więcej niż tylko rozwiązaniem do powtarzalnego pipetowania. Łącząc kontrolowaną manipulację próbkami z mikroskopią sterowaną programowo, staje się ona ważnym elementem składowym nowej generacji zautomatyzowanych i adaptacyjnych platform eksperymentalnych.

Originalpublikation: Basak, S.; Chi-Vu, K.; Mougios, N.; Oleksiievets, N.; Pollack, Y.G.; Brandenburg, S.; Opazo, F.; Lehnart, S.E.; Enderlein, J.*; Tsukanov, R.*, “A versatile microfluidics platform for enhanced multi-target super-resolution microscopy”. ACS Nano, 20 (2026)